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蛋白与蛋白相互作用分析—免疫共沉淀
  • 发布日期:2021-07-29      浏览次数:247
    •                                                              蛋白与蛋白相互作用分析—免疫共沉淀
                                                                            检硕科学上海有限公司
           实验原理

      免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法,是研究蛋白质相互作用的经典方法,主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。其原理是:当细胞在非变性条件下裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白,通过低速离心,可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。

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      实验步骤

      1.转染24-48 h后,刮取细胞,转移到15mL离心管,1000rpm离心5min,用冰预冷的PBS洗涤细胞一次,细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬,移至Eppendorf管,4°C 12000rpm离心1min,弃上清;

      2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液(用前新鲜加入蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次 (每次大约30sec),4℃ 12000rpm离心1 min,上清移至新的Eppendorf管;

      3.蛋白定量,每组取适量(通常100μg-1mg)蛋白,用细胞裂解液调整体积使每组一致(通常总体积500-1000μL),加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠;

      4.4°C孵育30min – 2h,以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合(pre-clear);

      5.4°C,2500rpm 离心3 min,上清移至新的Eppendorf管;

      6.加入第一抗体,4°C旋转孵育过夜;

      7.次日,每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠,4°C缓慢旋转孵育1–3h;

      8.4°C,2500rpm 离心3 min,小心吸去上清,琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3-4次;每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min;

      9.最后一次吸干所有液体,加入40μl的1×SDS 上样缓冲液,Vortex,然后用离心机轻甩30sec;

      10.沸水煮5分钟,12,000rpm离心1min;

      11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。

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      注意事项

      1.本实验需要在4°C进行。

      2.细胞裂解采用温和的裂解缓冲液,不能破坏细胞内存在的蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。

      3.为防止蛋白的降解,细胞裂解缓冲液必须新鲜加入蛋白酶抑制剂,如Roche的cocktail inhibitor。

      4.要注意抗体的选择,并不是所有抗体都适合做IP,需要仔细检查抗体的说明书,说明书上标注适用于IP的才行。

      5.要使用对照抗体,以确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的,而不是与抗体的非特异结合。

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      个人心得

      1.通常孵育时溶液的总体积小于离心管容积的1/2,这样有利于溶液的充分混合以保证抗原抗体的充分结合。

      2.蛋白裂解液与抗体孵育后,加入Protein A/G琼脂糖珠前,可对Protein A/G琼脂糖珠用蛋白裂解液洗涤一次,可将几组需要的琼脂糖珠一并进行洗涤,然后用蛋白裂解液重悬后再平均分到各组,这样可以避免每管所加琼脂糖珠在体积上的差异。

      3.检测过表达蛋白的相互作用,用标签抗体进行免疫沉淀比较容易,细胞裂解液需要的量较少(100-200μg);而检测内源性蛋白的相互作用,细胞裂解液需要的量较多(1-5mg),并且对抗体的要求更高,务必确定该抗体适用于做免疫沉淀,选择好用的抗体,最好参考文献。

      4.检测过表达蛋白的相互作用,转染24h后就可有高水平的表达,但通常我们选择转染后36h收细胞进行实验。

      5.先将细胞裂解液与抗体孵育,再与Protein A/G琼脂糖珠孵育是一种方法,也可将抗体先与Protein A/G琼脂糖珠孵育,再与pre-clear过的蛋白裂解液孵育也是可行的。二者在结果上没有明显差别。

      6.洗涤可以将样品置于4°C缓慢旋转孵育5-10min,也可手工颠倒混匀,然后放于冰上,重复几次,感觉前者比较方便。

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      NP-40裂解液配方(100ml)

      NaCl:               0.8766g

      NP-40:              0.5ml

      Tris-Hcl:            Tris-Hcl:0.6057g;  Hcl:210ul

      去离子水补齐至100ml

                                                                                                                                               本篇转至实验之家


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