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液相流动相稀释剂的选择
  • 发布日期:2021-07-19      浏览次数:134
    •     液相流动相稀释剂的选择

                                                  检硕科学上海有限公司

      分析方法开发,如何确定稀释剂,确保方法的适用性。

      1、稀释剂的干扰

      选择稀释剂,首先应考虑采用流动相体系,应关注以下几点:

      稀释剂不得干扰已知杂质及主峰的检测。

      根据化合物的溶解特定,可适当加入助溶剂,但最好控制在5%以内,避免强溶剂效应。

      允许对照品溶液与供试品溶液配制方式有差异,但对照品所添加的助溶剂一般应控制在2%以内,必免溶剂效应产生不良影响(如峰型、保留时间、峰响应等与供试品有差异,导致无法准确定量)。

      2、关注各杂质及主成分的溶解度

      通常有关物质方法中主成分的浓度较大(1mg/ml~10mg/ml),若主成分在稀释剂中的浓度接近其饱和溶解度,可能出现以下三种情况:

      供试品提取不充分,导致杂质测定结果偏低,部分未知杂质存在无法检出风险。

      供试品提取重现性差,导致杂质测定结果重现性差。

      样品在检测过程中有析出,存在影响杂质准确定量的风险。

      因此在进行方法摸索时,需测定相关主成分在稀释剂中的饱和溶解度,最好满足饱和溶解度大于3倍的供试品浓度。

      3、关注各杂质及主成分的稳定性

      基于杂质谱分析,配制混标,考察混标中各杂质及主成分的稳定性。

      部分杂质峰面积明显降低,可根据该类型化合物的结构特点,调整稀释剂的组成或注明供试品溶液的保存条件(如避光、冷藏等)。

      部分杂质峰面积明显升高,结合主成分的结构特点,调整稀释剂的组成或注明供试品溶液的保存条件(如避光、冷藏等)。

      临用新制",应注明时间,确保测定数据的准确性。若稳定性小于方法运行时间,个人认为是不可接受的。

      4、关注溶剂效应

      溶剂效应原定义为溶剂对于反应速率、平衡甚至反应机理的影响。针对于分析方法,主要指的是对溶解平衡的影响,涉及稀释剂与流动相、流动相与固定相。

      4.1、稀释剂选择不当引起的溶剂效应-现象及原理

      样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象,其过程为当溶解样品的溶剂不同于流动相时,样品溶剂与流动相发生混合,样品溶剂被冲稀。如果进样溶剂之强度高于流动相,样品在瞬间会表现为在较强溶剂中,并以较快速度通过色谱柱。色谱行为就是色谱峰的保留时间缩短。`当进样溶剂与流动相混合时,一部分分子会先与流动相混合,致使这些分子通过色谱柱的速度发生变化,使峰形扭曲,发生变形。

      4.2、稀释剂选择不当引起的溶剂效应-如何判定

      通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱,第一就是通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱,看看他们是否能完全一样的μV特征吸收,第二将进样体积调节到0.1μl看看,峰是否好转,如果满足上面两个条件几乎就可以肯定是100%的溶剂效应。

      4.3、稀释剂选择不当引起的溶剂效应-如何避免

      降低稀释的强度(如增加水相比例、调整pH等)或更换稀释剂为流动相,2、在保证检测灵敏度的前提下,降低进样量。3、增加峰形前延抑制器,峰形前延抑制器的设计原理是,在色谱柱前端引入一个大小合适的空腔,使样品到达色谱前被存留于空腔内的流动相(色谱柱平衡时流动相会充满空腔)稀释,使样品溶剂"经稀释后更接近流动相的组成,实现样品溶剂与流动相的组成接近",并取代用流动相溶解样品"的解决方案。

      4.4、基质效应(溶剂效应的一个变种)

      基质效应是指检测系统检测样品中的分析物时,处于分析物周围的所有非分析物质对分析物测定的影响。产生基质效应的原因与以下四个因素有关:仪器的设计、试剂的组成成分、测试方法的原理、质控材料的组成及处理技术等,通过回收率可以评估分析方法是否受基质效应的影响,一般若回收率普遍偏低、偏高或波动较大,建议考虑基质效应的影响。

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